Cette vidéo montre l’analyse d’échantillons de peptides à partir de granules de neuromélanine (NMG) isolés dans des tissus cérébraux humains post-mortem. Les peptides sont d’abord séparés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), puis analysés par spectrométrie de masse pour déterminer leur rapport masse/charge (m/z). Les peptides ciblés sont fragmentés pour identifier les modifications post-traductionnelles et les données résultantes sont comparées à une base de données de référence pour déterminer le profil protéomique des NMGs.
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Article de méthode
Analyse LC-MS/MS du profil protéomique de granules de neuromélanine isolés dans le tissu cérébral humain
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28 avril 2025
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Digestion tryptique
1. Décongeler les échantillons sur de la glace.
2. Sécher complètement les échantillons dans un concentrateur sous vide.
3. Remplissez l’échantillon avec 50 μL d’un tampon de digestion approprié, par exemple 50 mM de bicarbonate d’ammonium.
4. Après l’ajout de 1,25 μL de 1,4-dithiothréitol de 200 mM, incuber les échantillons pendant 30 min à 60 °C et 300 tr/min à l’aide d’un thermomélangeur et les refroidir ensuite à température ambiante (RT).
5. Ensuite, incuber les échantillons à RT pendant 30 min dans l’obscurité après l’ajout de 1,36 μL 0,55 M d’iodoacétamide.
6. Ajouter une quantité appropriée de trypsine aux échantillons et incuber les échantillons pendant la nuit (~16 h) à 37 °C.
REMARQUE : Pour 1 000 000 μm2, 0,1 μg de trypsine s’est avéré suffisant.
7. Ajouter 2,6 μL d’acide trifluoroacétique (AGT) à 10 % dans les échantillons pour arrêter la digestion (concentration finale de 0,5 % d’AGT).
8. Séchez complètement les échantillons à l’aide d’un concentrateur sous vide. Ensuite, remplissez les échantillons jusqu’à un volume final défini avec 0,1 % de TFA. Des échantillons de NMG ont été remplis jusqu’à 20 μL, dont 5 μL ont été utilisés pour une expérience de spectrométrie de masse (MS).
9. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à nouvel ordre. Déterminer la concentration peptidique par l’analyse des acides aminés ou une autre méthode de quantification appropriée (p. ex., détection directe).
NOTE : De faibles quantités d’échantillons peuvent ne pas être quantifiables à l’aide des techniques mentionnées. Pour assurer un chargement d’échantillon identique, chaque échantillon doit contenir la même quantité de tissu isolé et chaque échantillon doit être traité de la même manière.
2. Chromatographie liquide haute performance et spectrométrie de masse
REMARQUE : Les analyses de spectrométrie de masse (MS) de chromatographie liquide haute performance (HPLC) suivantes sont optimisées pour le système LC spécifique avec un dispositif de colonne de piégeage et un spectromètre de masse utilisés ici (voir Tableau des matériaux). Pour les autres systèmes LC et MS, il est recommandé d’adapter les paramètres.
- À l’aide du logiciel Xcalibur, ajustez les paramètres HPLC comme suit.
- Colonne de piège : Régler la température à 60 °C, le débit à 30 μL/min, le tampon de fonctionnement à 0,1 % d’acide trifluoroacétique.
- Colonne analytique en phase inverse C18 : régler la température à 60 °C, le débit à 30 μL/min, le tampon de fonctionnement A à 0,1 % d’acide trifluoroacétique, le tampon de fonctionnement B à 84 % d’acétonitrile et le gradient à 5 % à 30 % du tampon de fonctionnement B sur 98 min.
REMARQUE : L’adaptation du gradient peut être inévitable et est fortement recommandée lors de l’utilisation de différents tissus ou cellules. Le temps total du gradient peut varier en raison du chargement de l’échantillon au début du gradient et du lavage de l’échantillon à la fin du gradient. Le gradient total dans ce protocole se compose d’un chargement d’échantillon de 7 minutes et d’un lavage de colonne supplémentaire pendant 15 min, ce qui donne un temps de gradient total de 120 min.
- Créez une méthode d’acquisition dépendante des données (DDA) à l’aide de la configuration de l’instrument XCalibur, qui se trouve dans le menu de la feuille de route du logiciel HPLC.
- Dans l’onglet Paramètres globaux , définissez le mode d’infusion Chromatographie liquide, le Largeur de crête LC attendue (30 s), et l’état de charge par défaut (2).
- Passez à l’onglet Paramètres de balayage et ajoutez les balayages et filtres suivants dans l’ordre mentionné : MS OT, MIPS, Intensité, État de charge, Exclusion dynamique, et dMS2 OT HCD.
Les réglages optimaux de la MS et de la DDA peuvent varier en fonction du spectromètre de masse utilisé ainsi que du type d’échantillon et doivent donc être adaptés. - Préparez les échantillons en dissolvant 200 à 400 ng de peptides d’échantillon dans un volume défini de 0,1 % de TFA dans des entrées de flacons en verre inertes par spectrométrie de masse. Si la détermination de la concentration n’est pas applicable en raison d’une faible quantité d’échantillon, vérifiez la charge identique de l’échantillon en comparant le courant ionique total (TIC).
REMARQUE : Pour ce faire, ouvrez le fichier résultant de la mesure spectrométrique de masse dans un logiciel approprié, par exemple FreeStyle, et vérifiez le chromatogramme. Les intensités doivent être comparables pour tous les échantillons. Un TIC représentatif est illustré dans Figure 1. - Analysez les données brutes obtenues à l’aide d’un logiciel adapté à la protéomique, par exemple, MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics ou Proteome Discoverer, et effectuez une analyse statistique des données basée sur la question de recherche.
3. Analyse des données brutes protéomiques à l’aide de MaxQuant
- Chargez les fichiers bruts dans le logiciel MaxQuant dans l’en-tête des données brutes en cliquant sur Charger.
- Attribuez des noms d’échantillons en cliquant sur Set Experiment.
- Définissez des paramètres spécifiques au groupe. Tout d’abord, ajoutez des modifications. En raison du traitement de l’échantillon, choisissez Déamidation (NQ), Oxydation (M) et Carbamidométhylation (N-term) comme modifications de variables, et ajoutez Carbamidométhylation (C) comme modification fixe.
- Choisissez Trypsine comme enzyme de digestion dans l’onglet Digestion .
- Ajouter l’option de quantification sans étiquette LFQ dans l’onglet Quantification sans étiquette . Si plus de 10 fichiers doivent être traités, choisissez l’option Fast LFQ pour raccourcir le temps de traitement. Ajouter l’option iBAQ comme mesure pour la quantification des protéines.
- Assurez-vous que tous les autres paramètres spécifiques au groupe restent dans les paramètres d’usine.
- Passez à l’onglet Paramètres globaux et ajoutez le fichier FASTA dérivé de uniprot.org dans l’onglet Séquences . Modifiez la règle d’identification en conséquence et ajoutez l’ID de taxonomie, dans ce cas, 9606 pour homo sapiens.
- Pour la quantification des protéines, choisissez les peptides Unique et Razor.
- Assurez-vous que tous les autres paramètres globaux restent dans les paramètres d’usine.
- Cliquez sur Démarrer et récupérez le proteingroups.txt après l’analyse MaxQuant pour une analyse plus approfondie dans Perseus.
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Résultats
Figure 1 : Courant ionique total (TIC) d’une mesure DDA de 120 min. Le chromatogramme montre l’abondance relative des ions correspondant aux peptides éluants sur l...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | < |
| Merck | 1.00029.2500 | ||
| Bicarbonate d’ammonium | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| acide formique | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | < |
| Carl Zeiss | 415190-9221-000 | ||
| Spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| Acide trifluoroacétique | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Nom du logiciel | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | < |
| https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | ||
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/< | ||
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view< | ||
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
